Aplicación de un multiplex RT-PCR en tiempo real para la detección rápida y específica de cuatro Arbovirus de importancia en Salud Pública.

Director de proyecto: Blgo. Gabriel Adolfo Morey León

Contacto: gabriel.moreyl@ug.edu.ec         moreyg@live.com

En la actualidad la emergencia y re-emergencia de arbovirus (virus de ARN transmitidos por  artrópodos)  es  una  problemática  de  gran  importancia  en  Salud  Pública  a  nivel  mundial. Varios de estos arbovirus son transmitidos por mosquitos, especialmente Aedes aegypti,  considerado  un  vector  importante  en  la  transmisión  de  enfermedades  en  las  regiones  tropicales  y  subtropicales.  Uno  de  los  principales  arbovirus  reportados  en Sudamérica y transmitidos por Aedes aegypti es el virus del dengue (DENV) un Flavivirus  causante de una de las enfermedades de mayor importancia en las regiones tropicales y subtropicales  a  nivel  mundial.  Sin  embargo,  los  virus  Chikungunya  (CHIKV),  Zika  (ZIKV) y Mayaro (MAYV) han re-emergido como importantes arbovirus causantes de epidemias en Asia, África y América. En áreas donde el virus del dengue es endémico, la  co-circulación  de  estos  otros  arbovirus,  en  muchos  casos  ha  sido  mal  clasificada  y diagnosticados como dengue basado en datos clínicos-epidemiológicos, subvalorando la  incidencia real. El proyecto tiene como objetivo desarrollar una prueba multiplex PCR en  tiempo real para la detección  y cuantificación de 4 arbovirus (Dengue, Chikungunya,  Mayaro  y  Zika)  de  importancia  en  Salud  Pública.  Se  utilizarán  sondas  marcadas  que  reconocerán  regiones específicas de  cada virus,  que permita detectar  y diferenciar de  forma sensible y específica los 4 arbovirus. La amplificación se realizará mediante RT-qPCR de un solo ó dos pasos a partir de cDNA de cada virus, determinando su límite de  detección.  Se  espera  obtener  una  prueba  que  se  pueda  utilizar  en  formato  dúplex  y  multiplex permitiendo detectar los 4 arbovirus, sugiriendo su utilización en los sistemas  de  vigilancia  epidemiológica;  así  como  también  desarrollar  las  capacidades  de investigación  y  rápida  respuesta  de  los  investigadores  de  la  institución  frente  a  la presencia de arbovirus que afecten a la población y que se encuentran en países vecinos.

La  incidencia  global  de  arbovirus  se  ha  incrementado  en  los  últimos  25  años,  principalmente por el crecimiento poblacional, la migración, urbanización descontrolada  y ausencia de un control efectivo del mosquito (Gubler, 2002). Los arbovirus son un gran  grupo de virus zoonóticos de ARN mantenidos en la naturaleza en ciclos que involucran  vectores  artrópodos  hematófagos  y  un  amplio  rango  de  hospederos  vertebrados.  La  mayoría pertenecientes a las familias Togaviridae, Flaviviridae y Bunyaviridae. Los virus  Dengue  (DENV,  Flavivirus,  Flaviviridae),  Chikungunya  (CHIKV,  Alphavirus,  Togaviridae),  Zika  (ZIKV,  Flavivirus,  Flaviviridae)  y  Mayaro  (MAYV,  Alphavirus,  Togaviridae) son unos de los tanto virus transmitidos por artrópodos (arbovirus). Debido  a que las manifestaciones clínicas y síntomas tales como fiebre repentina, dolor de cabeza,  artralgias,  mialgias  y  erupciones  cutáneas  causadas  por  infecciones  con  arbovirus  en  humanos  son  muy  similares  y  en  ciertos  casos  indistinguibles,  la  implementación  de  sistemas  de  detección  más  rápidos  durante  la  fase  de  viremia  de  la  enfermedad  son  necesarios para proporcionar diferenciación etiológica. 

La captura de anticuerpos IgM es considerado el estándar diagnóstico de la infección de  arbovirus durante la fase aguda pero permite la detección 5-7 días después de la aparición  de la enfermedad (Goh et al., 2015; Wasonga et al., 2015; Li et al., 2014; Izurieta et al  2011; Navarrete-Espinoza et al 2006;) y se ve limitada por las reacciones cruzadas entre  los miembros de los Flavivirus y Alfavirus (Martin et al., 2000). Las técnicas moleculares  de    detección  de  ácidos  nucleicos  (NAT)  sin  embargo,  han  sido  consideradas  como  estrategias rápidas de detección debido a la especificidad y sensibilidad que presentan,  pudiendo utilizárseles en las etapas tempranas de la enfermedad. 

En Dengue un gran número de pruebas moleculares se han desarrollado teniendo como  blanco los genes NS1, NS5 y E basados en la amplificación de secuencias específicas,  llegando a desarrollarse pruebas basadas en RT-PCR, RT-PCR en tiempo real utilizando  diferentes reporteros, RT-LAMP etc (Klungthong et al., 2015; Sasmono et al., 2014; Alm et al., 2014; Pang et al., 2014; Waggoner et al 2014; Waggoner et al 2013c; Paudel et al., 2011). Para Chikungunya han sido utilizadas y desarrolladas pruebas dirigidas a los genes  E  como  blancos  de  detección  basadas  en  RT-PCR,  RT-PCR  en  tiempo  real,  LAMP (Cecilia  et al., 2015; Agarwal  et al., 2013; Reddy et al., 2012; Pongsiri et al., 2012; Hoet al., 2012; Lu et al., 2012; Sharma et al., 2010; Ummul et al., 2010; Panning et al., 2009; Laurent  et al., 2007; Santhosh et al., 2007; Parida et al., 2007; Pastorino et al., 2005;  Pfeffer  et  al.,  2002).  Para  Zika  virus  pocas  pruebas  moleculares  han  sido  desarrolladas  principalmente  basadas  en  RT-PCR,  aunque  últimamente  se  han  comenzado a desarrollar pruebas basadas en PCR en tiempo real (Faye et al., 2013; Balm  et al., 2012; Moureau et al., 2007); Y en el caso del virus Mayaro la principal prueba de  detección ha sido basada en anticuerpos, pero recientemente se reportó mediante análisis  por RT-PCR la presencia de Mayaro durante los brotes de dengue en Brasil (Vieira et al  2015; Gomes Mourao et al., 2012).

En base a lo reportado anteriormente, existen diferentes pruebas de detección pero hasta  el momento ninguna prueba contempla el desarrollo de una multiplex para la detección  de estos 4 arbovirus de importancia en salud, considerando que existe la alta probabilidad  de presencia de los 4 arbovirus en el país debido al vector, es conveniente y parte del  objetivo  de  este  proyecto  el  desarrollo  de  una  prueba  en  formato  multiplex  para  la  detección y cuantificación de los mismos que ayudaría a conocer los niveles de infección  real dentro del país, en caso de existir o para mantener la vigilancia epidemiológica en caso de brotes futuros.

Objetivos específicos:

Desarrollar  una  multiplex  PCR  en  tiempo  real  para  la  detección,  identificación  y  cuantificación de 4 arbovirus (Dengue, Chikungunya, Mayaro y Zika) de importancia en  Salud Pública en el país, la misma que pueda ser utilizada en formato dúplex y multiplex,  sugiriendo su utilización en los sistemas de vigilancia epidemiológica, conduciendo a   desarrollar las capacidades de rápida  respuesta de los  investigadores de la institución  frente a la presencia de arbovirus que afectan a la población y que se encuentran en países  vecinos.

Resultados:

1. Lista de regiones idóneas para el diseño de iniciadores y sondas para la detección de los 4 arbovirus.
2. Secuencias de iniciadores y sondas específicas para cada arbovirus
3. Protocolo optimizado  de  amplificación  por  RT-qPCR  para  cada  arbovirus (monoplex).
4. Determinación del límite de detección (LOD) y especificidad de detección por RT- qPCR para cada arbovirus (monoplex).

Protocolo optimizado de amplificación por múltiplex RT-qPCR para la detección e identificación de los 4 arbovirus.

6. Determinación del límite de detección (LOD) y especificidad de la múltiplex RT- qPCR para la detección e identificación de los 4 arbovirus.
7. Establecimiento de la efectividad de la prueba (monoplex y multiplex) mediante la determinación valores  de  sensibilidad,  especificidad,  valor  predictivo  positivo

(VPP), valor predictivo negativo (VPN), eficacia diagnostica, razón de probabilidad positiva, razón de probabilidad negativa.

8.  01 prueba de múltiplex RT-qPCR que permita la detección rápida y específica de los 4 arbovirus.